对PCR产物克隆略有简短的反应。
PCR产物的克隆大致分为两类，平头连接和粘头连接。
平头连接是将制备的平头载体直接连接到扁平或扁平的PCR产物。
可以使用EcoRV或SmaI用平头切割载体。PCR产物的纯化（使用3种酶“→5”外切酶活性和5“→3”聚合酶活性）可以用它在22℃下30分钟DNA聚合酶I进行处理
如果要求不高，您也可以不对PCR产品进行处理。
当使用Strafugene的pfu时
来自NewEngland Biolabs的DNA聚合酶或通气
DNA聚合酶，这两种酶具有5'→3'校正能力，扩增的PCR产物已经是扁平的，可以在没有钝端的情况下进行处理。
扁平末端连接的明显缺点是即使使用非常高的连接酶单位或向反应系统中添加PEG也无效结合。
8000只能提高非常有限的效率。
粘合头连接也可以分为两类。粘合头连接的类型是在支撑产品和PCR产品上形成长的，互补的粘性末端的方式。
最常见的方法是在引物的5'末端添加限制酶识别序列。
如果两种引物使用不同的限制性内切核酸酶识别序列，则可以实现定向连接。
其他类使用部分PCR产物3'末端的独特dAMP特征构建在3'末端具有显着dTMP的载体。
常用的方法是使用第一限制性内切酶消化该载体在一平头，并且只有一个在反应体系中的dTTP的dNTP，Taq酶在70或72加入。
用DNA聚合酶处理半小时（处理1-2小时可以提高克隆效率，因此据报道T反应更完整）。
也可以使用末端转移酶完成T反应。
载体是自连接的，并且可以忽略PCR产物的串联。
如果使用ddTTP，效果会更好。
这种方法通常称为T / A方法的增加，其效率比扁平连接高50到100倍。
TA克隆PCR产物。
1
TA克隆的构建原理：来自Invitrogen（Sun）的TA克隆系统
由Diego California开发的用于克隆和测序PCR产物的市售试剂盒。
其原理是，在添加使用Taq酶的PCR产物的3“端，和T载体的非模板依赖性的是具有3'T悬垂一个载体，它是快速和逐渐例如。将PCR产物直接插入质粒载体的多克隆位点（MCS）。
2
操作程序
连接反应通常在0℃下无菌。
用5ml离心管进行。
反应体系的体积为10μl。
取1μl（50ng）T载体并加入等摩尔PCR产物。
加入ATP，10μl含有适当单位T4 DNA连接酶的10μl缓冲液，并用10μl与ddH 2 O完成。
。
稍微离心，通常14至14小时，14至14小时，或夜间4次。
如前所述筛分蓝色和白色转染斑点。
其次，这是一个需要注意的问题。
1
为了获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性更好。
2
在克隆之前用TA纯化PCR产物。
3
在PCR产物的回收和纯化过程中避免了额外DNA的污染。